T.KOLİFORM BAKTERİ ve E.COLİ TAYİNİ
(ÇOKLU TÜP YÖNTEMİ)

Çalışma Yöntemi

Numune Su Toplamada Kullanılacak Şişelerinin Hazırlanması  

  1. Numuneyi ışık etkisinden koruyacak kahverengi 120 mL’lik şişeler kullanılır.
  2. Şişeler bol su ile yıkanır.
  3. Şişelere Sodyum Tiyosülfatın %3’lük çözeltisinden 0.1 mL ilave edilir.
  4. Şişe ağızları hidrofil pamuk ile kapatılır ve kâğıt ile sarılır.
  5. 175°C’da iki saat tutularak steril edilir.
  6. Daha sonra şişelerin ağızlarına takılacak olan mantarlar kağıda sarılarak 121°C sıcaklıkta ve 1.2 atmosfer basınç 30 dakika süre ile tutularak steril edilir.
  7. Steril edilen şişe ve mantarlardan kâğıt ve pamuklar çıkarılır ve bek alevi karşısında şişe ağızları mantarla kapatılır.
  8. Kapatma sırasında kâğıt ve pamuğu alınan şişe ağzı bek alevi ile yakılır ve kâğıdı çıkarılmış mantar yakılarak şişe ağzı kapatılır.
  9. Numune alınacağı zaman şişe ağzı ve mantarın şişe ağzını kapatan kısmına temas etmemeye özen gösterilir.
    NOT: Polipropilen malzemeden yapılmış steril tek kullanımlık numune şişeleri de kullanılabilir.

 

Su Numunesinin Alınması

  1. Numune suyun alınacağı musluk açılır ve birkaç dakika akıtılır.
  2. 15–20 cm uzunlukta metal tel üzerine sarılıp, ispirtoya batırılmış pamuk yakılır.
  3. Musluk kapatılır ve yanmakta olan ispirtolu pamuk ile musluk yakılır.
  4. Musluk tekrar açılarak akıtılır.
  5. Bakteriyolojik şişenin ağzındaki mantar çıkarılır. Bu sırada mantarın şişe ile temas eden kısmına temas etmemeye özen gösterilir.
  6. Şişe ağzı yakılır.
  7. Şişe akmakta olan musluk suyu ile doldurulur. Su miktarının 105–110 mL’den az olmamasına dikkat edilir.
  8. Şişe ağzı yakılır.
  9. Mantarın şişe ağzı ile temas eden kısmı yakılır.
  10. Şişe ağzı mantar ile kapatılır.

 

Su Numunesinin Korunması

  1. Bakteri sayısındaki değişimi minimize etmek için toplanan su numuneleri mümkün olan en kısa sürede analiz edilmelidir.
  2. Numunelerin toplanması ve analizi arasında geçen maksimum süre 8 saati aşmamalıdır.
  3. Numunelerin laboratuvara ulaşması için geçecek süre 6 saati aşmamalıdır.
  4. Numuneler alındıktan sonra laboratuvara ulaştırılıncaya kadar karanlıkta ve 25°C’ı aşmayan bir sıcaklıkta tutulmalıdır.
  5. Analiz 8 saat içinde tamamlanamayacak ise örnekler dondurulmadan 4°C’da saklanmalıdır.
  6. Numunenin toplanması ile analiz edilmesi arasındaki sürenin 24 saati aşmamasına azami dikkat gösterilmelidir.

 

Tahmin Deneyi

  1. 10 Adet besi yeri–1 içeren tüp, tüp taşıyıcıya dizilir.
  2. Numune iyice çalkalanır.
  3. Her tüpe 10 mL numune su ilave edilir.
  4. Numune su içeren bu tüpler 35±0.5°C’lık inkübatörde 24±2 saat süre bekletilir.
  5. 24±2 saatlik inkübasyon sonunda deney tüpleri içerisine ters yerleştirilmiş Durham tüplerinde gaz veya bir bulanmanın olup olmadığı kontrol edilir.
  6. Gaz oluşmuş ise burada bir üreme olduğu kabul edilir ve doğrulama deneyine geçilir.
  7. Eğer tüplerde gaz oluşumu ve bulanıklık tespit edilmez ise 48±3 saatin sonuna kadar inkübasyona devam edilir.
  8. Bu süre sonunda tüplerin hiçbirinde gaz oluşmamışsa numunenin ekilen miktarında koliform bakteri bulunmadığı kabul edilir.
  9. Gaz oluşmuş ise burada bir üreme olduğu kabul edilir ve doğrulama deneyine geçilir.

 

Doğrulama Deneyi

  1. Tahmin deneyinde gaz oluşumu görülen tüpler hafif şekilde çalkalanır.
  2. Steril 3 mm’lik öze ile bu tüplerden birkaç öze gözü alınır.
  3. Alınan bu öze gözleri besi yeri–2 içeren tüplere inoküle (aktarılır) edilir.
  4. Bu işlem gaz veren tüplerin hepsine uygulanır.
  5. Besi yeri–2 içeren inoküle edilmiş tüpler 35±0.5°C’lık inkübatörde 48±3 saat süre bekletilir.
  6. Bekleme süresi içinde herhangi bir zamanda Durham tüpleri içinde gaz görülürse, tahmin deneyindeki pozitif reaksiyon doğrulanmış pozitif koliform olarak kaydedilir.
  7. Benzer şekilde inkübasyon süresi sonunda gaz oluşumu görülen tüpler kaydedilir.
  8. Doğrulama deneyindeki pozitif tüplerin (Durham tüpleri içerisinde gaz oluşturan tüpler) toplam sayısına göre hesaplama bölümündeki tablodan bulunan değer, numunenin 100 mL’deki toplam koliform değeri olarak rapor edilir.

 

Tamamlama Deneyi

  1. Doğrulama deneyine paralel olarak yürütülür.
    NOT:
    Doğrulama deneyinde pozitif sonuç veren (Durham tüplerinde gaz oluşan) tüpler kullanılarak da tamamlama deneyi yapılabilir. Ancak böyle bir durumda analizin tamamlanması daha uzun süre alacağı için, bu kitapta doğrulama ve tamamlama deneyleri paralel çalışılacak şekilde anlatılmıştır.
  2. Tahmin deneyinde gaz oluşumu görülen tüpler hafif şekilde çalkalanır.
  3. Steril 3 mm’lik öze ile bu tüplerden birkaç öze gözü alınır.
  4. Alınan bu öze gözleri besi yeri–3 içeren tüplere inoküle edilir.
  5. Bu işlem gaz veren tüplerin hepsine uygulanır.
  6. Besi yeri–3 içeren inoküle edilmiş tüpler 44.5±0.2°C’lık su banyosunda 24±2 saat süre bekletilir.
  7. Bu sıcaklıkta pozitif sonuç veren (Durham tüplerinde gaz oluşan) tüpler suda fekal koliform var olduğunu, negatif sonuç veren (Durham tüplerinde gaz oluşmamış ise) tüpler sudaki fekal koliform olmadığını (nonfekal olduğunu) gösterir.
  8. Tamamlama deneyindeki pozitif tüplerin (Durham tüpleri içerisinde gaz oluşturan tüpler) toplam sayısına göre hesaplama bölümündeki tablodan bulunan değer, numunenin 100 mL’deki fekal koliform değeri olarak rapor edilir.