T.KOLİFORM BAKTERİ ve E.COLİ TAYİNİ
(ÇOKLU TÜP YÖNTEMİ)

Kullanılan Cihazlar

İnkübatör–1: 35±0.5°C’lık ortam sıcaklığı sağlayan inkübatör kullanılır. İnkübasyon sırasındaki nem kaybının %15’den fazla olmaması için inkübatörün en altına bir kap içinde su koymak yeterli olabilir. 

Otoklav (Buharlı Sterilizatör): 121°C’lık sıcaklık ve 1.2 atmosfer basıncı sağlayan otoklav kullanılır. 

Fırın: 175°C’lık sıcaklık sağlayan fırın sterilizasyon işleminde kullanılır. 

Analitik Terazi: Terazi 0.1 mg hassasiyete sahip olmalıdır. 

Su Banyosu: Su sıcaklığı 0.2°C hassasiyetle ayarlanabilen, 100°C su sıcaklığı sağlayan su banyosu kullanılır. 

pH Metre: pH metre 0.1 birim hassasiyete sahip olmalıdır. 

Mikroskop: Normal ışık mikroskopu kullanılır. 

Bunsen Beki: Doğalgaz veya LPG gaz ile çalışabilen bunsen beki yakma işlemlerinde kullanılır. 

Deney Tüpleri: 18 mm çaplı 180 mm uzunluğundaki deney tüpleri kullanılır. Otoklava konduğunda ağzını kapatacak klipsli kapağı da bulunmalıdır. Deney tüpleri tüp taşıyıcı ile birlikte kullanılır.

Durham Tüpleri: 6 mm çaplı 50 mm uzunluğundaki tüpleri kullanılır. Deney tüpleri içine ters yerleştirilerek oluşan gaz hapsedilir. 

Spatül ve Özeler: Steril edilmiş spatül ve özeler kullanılır. Çalışma esnasında kızıl dereceye kadar ısıtılır. Tüp kenarında (besi yeri içinde üremeden uzak noktada) soğutulur. Aktarma işleminde kullanılır.

 

Kullanılan Kimyasal Maddeler

Besi Yeri–1 (Lauryl Sulfate Tryptose Broth):

  1. Kullanılan Kimyasallar: Difco marka (224150), Oxoid marka (CM0451), Fluka marka (17349), Merck marka (110266) hazır besi yeri veya tryptose, lactose, di-potasyum hidrojen fosfat, potasyum di-hidrojen fosfat, sodyum klorür, sodyum lauryl sülfat kullanılarak hazırlanan besi yeri kullanılır.                                                                   
  2. Hazırlanışı; hazır besi yerinin 35.6 gramı veya kimyasal maddelerin aşağıda verilen miktarlar 1 L saf su ile bir balon içerisine konur ve eriyinceye kadar ısıtılır.

    Tryptose 20.0 g
    Lactose  5.0 g
    Di-potasyum Hidrojen Fosfat 2.75 g
    Potasyum Di-hidrojen Fosfat     2.75 g
    Sodyum Klorür 5.0 g
    Sodyum Lauryl Sülfat 0.10 g

    Hazırlanan besi yeri içinde ters şekilde Durham tüpü bulunan tüplere 10 mL olarak dağıtılır. Sterilizasyondan sonrada besi yeri seviyesinin Durham tüplerinin üzerinde olmasına özen gösterilir. Tüplerin ağzı kapatılarak otoklavda 121°C sıcaklıkta 15 dakika tutularak steril hale getirilir. Sterilizasyondan sonra pH=6.8±0.2 olmalıdır. Sterilizasyon işleminden sonra buzdolabına kaldırılmış ise, kullanmadan önce 20°C’de (oda sıcaklığında) bir gece bekletilir. Bu sırada kirlenen, renk değiştiren ve kabarcık üreten tüpler kullanılmaz. Ayrıca çift güçlü besi yeri hazırlanmak istendiğinde su hariç diğer maddelerin iki katı tartılarak hazırlanır.

  3. Besi yerinin bakteriler tarafından kullanılması sırasında oluşan reaksiyondan faydalanılarak bakteriler tespit edilir. Tahmin deneyinde kullanılır. 

Besi Yeri–2 (Brilliant Green Lactose Bile Broth):

  1. Kullanılan Kimyasallar: Difco marka (274000), Oxoid marka (CM0031), Fluka marka (16025), Merck marka (105454) hazır besi yeri veya peptone, lactose, ox bile, brillant green kullanılarak hazırlanan besi yeri kullanılır.                           
  2. Hazırlanışı; hazır besi yerinin 40.0 gramı 1 L saf su ile bir balon içerisine konur ve eriyinceye kadar ısıtılır veya peptone, lactose, ox bile verilen miktarları saf suya ilave edilir ve ısıtılarak çözülür. Brillant green’in %0.1’lik çözeltisinden 13.3 mL ilave edilir ve litreye tamamlanır.

    Peptone 10.0 g
    Lactose     10.0 g
    Ox bile (Oxgall)    20.0 g
    Brillant Green 0.0133 g

    Hazırlanan besi yeri içinde ters şekilde Durham tüpü bulunan tüplere 10 mL olarak dağıtılır. Sterilizasyondan sonrada besi yeri seviyesinin Durham tüplerinin üzerinde olmasına özen gösterilir. Tüplerin ağzı kapatılarak otoklavda 121°C sıcaklıkta 15 dakika tutularak steril hale getirilir. Sterilizasyondan sonra pH=7.3±0.3 olmalıdır.

  3. Besi yerinin bakteriler tarafından kullanılması sırasında oluşan reaksiyondan faydalanılarak bakteriler tespit edilir. Doğrulama deneyinde kullanılır.

Besi Yeri–3 (EC Broth)

  1. Kullanılan Kimyasallar: Difco marka (231430), Oxoid marka (CM0853), Fluka marka (44653), Merck marka (110765) hazır besi yeri veya tryptose veya trypticase, lactose, bile salt no:3, di-potasyum hidrojen fosfat, potasyum di-hidrojen fosfat, sodyum klorür kullanılarak hazırlanan besi yeri kullanılır.                                                                                                        
  2. Hazırlanışı; hazır besi yerinin 37.0 gramı veya kimyasal maddelerin aşağıda verilen miktarlar 1 L saf su ile bir balon içerisine konur ve eriyinceye kadar ısıtılır.

    Tryptose veya Trypticase 20.0 g
    Lactose  5.0 g
    Bile Salt No:3  1.5 g
    Di-potasyum Hidrojen Fosfat     4.0 g
    Potasyum Di-hidrojen Fosfat 1.5 g
    Sodyum Klorür   5.0 g

    Hazırlanan besi yeri içinde ters şekilde Durham tüpü bulunan tüplere 8 mL olarak dağıtılır. Sterilizasyondan sonrada besi yeri seviyesinin Durham tüplerinin üzerinde olmasına özen gösterilir. Tüplerin ağzı kapatılarak otoklavda 121°C sıcaklıkta 15 dakika tutularak steril hale getirilir. Sterilizasyondan sonra pH=6.9±0.2 olmalıdır.

  3. Besi yerinin bakteriler tarafından tüketilmesi sağlanır ve oluşan reaksiyon kullanılarak fekal bakteriler tespit edilir. Tamamlama deneyinde kullanılır.