T.KOLİFORM BAKTERİ ve E.COLİ TAYİNİ
(
MEMBRAN FİLTRE YÖNTEMİ)

Çalışma Yöntemi

Numune Su Toplamada Kullanılacak Şişelerinin Hazırlanması  

  1. Numuneyi ışık etkisinden koruyacak kahverengi 120 mL’lik şişeler kullanılır.
  2. Şişeler bol su ile yıkanır.
  3. Şişelere Sodyum Tiyosülfatın %3’lük çözeltisinden 0.1 mL ilave edilir.
  4. Şişe ağızları hidrofil pamuk ile kapatılır ve kâğıt ile sarılır.
  5. 1750C’da iki saat tutularak steril edilir.
  6. Daha sonra şişelerin ağızlarına takılacak olan mantarlar kağıda sarılarak 1210C sıcaklıkta ve 1.2 atmosfer basınç 30 dakika süre ile tutularak steril edilir.
  7. Steril edilen şişe ve mantarlardan kâğıt ve pamuklar çıkarılır ve bek alevi karşısında şişe ağızları mantarla kapatılır.
  8. Kapatma sırasında kâğıt ve pamuğu alınan şişe ağzı bek alevi ile yakılır ve kâğıdı çıkarılmış mantar yakılarak şişe ağzı kapatılır.
  9. Numune alınacağı zaman şişe ağzı ve mantarın şişe ağzını kapatan kısmına temas etmemeye özen gösterilir.
    NOT: Polipropilen malzemeden yapılmış steril tek kullanımlık numune şişeleri de kullanılabilir.

 

Su Numunesinin Alınması

  1. Numune suyun alınacağı musluk açılır ve birkaç dakika akıtılır.
  2. 15–20 cm uzunlukta metal tel üzerine sarılıp, ispirtoya batırılmış pamuk yakılır.
  3. Musluk kapatılır ve yanmakta olan ispirtolu pamuk ile musluk yakılır.
  4. Musluk tekrar açılarak akıtılır.
  5. Bakteriyolojik şişenin ağzındaki mantar çıkarılır. Bu sırada mantarın şişe ile temas eden kısmına temas etmemeye özen gösterilir.
  6. Şişe ağzı yakılır.
  7. Şişe akmakta olan musluk suyu ile doldurulur. Su miktarının 105–110 mL’den az olmamasına dikkat edilir.
  8. Şişe ağzı yakılır.
  9. Mantarın şişe ağzı ile temas eden kısmı yakılır.
  10. Şişe ağzı mantar ile kapatılır.

 

Su Numunesinin Korunması

  1. Bakteri sayısındaki değişimi minimize etmek için toplanan su numuneleri mümkün olan en kısa sürede analiz edilmelidir.
  2. Numunelerin toplanması ve analizi arasında geçen maksimum süre 8 saati aşmamalıdır.
  3. Numunelerin laboratuvara ulaşması için geçecek süre 6 saati aşmamalıdır.
  4. Numuneler alındıktan sonra laboratuvara ulaştırılıncaya kadar karanlıkta ve 250C’ı aşmayan bir sıcaklıkta tutulmalıdır.
  5. Analiz 8 saat içinde tamamlanamayacak ise örnekler dondurulmadan 40C’da saklanmalıdır.
  6. Numunenin toplanması ile analiz edilmesi arasındaki sürenin 24 saati aşmamasına azami dikkat gösterilmelidir.

 

Tahmin Deneyi

  1. Süzme sisteminde filtre kâğıdının yerleştirildiği gözenekli kısma alkollü pamuk sürülür.
  2. Alkollü pamuk sürüldükten sonra bunsen beki alevi ile yakılır.
  3. Steril saf su ile yıkanır.
  4. Pens, busen beki alevinde çok kısa süre tutularak yakılır.
  5. Pens yardımı ile 0.45 µm gözenek açıklığı olan 47 mm çaplı çizgili steril membran filtre sistemin gözenekli kısmına yerleştirilir.
  6. Atılabilir 100 mL’lik steril huni membran filtrenin üzerine yerleştirilir.
  7. Numunenin kaynağına göre 1, 5, 10, 20, 50 ve 100 mL’lik bir hacim süzülür. Suyun kirli olma ihtimali arttıkça (örneğin; ham su) süzülecek numune hacmi küçültülür.
    NOT:
    Küçük numune hacimleri belirli bir miktar (50–100 mL) seyreltme suyu (Peptone’lu su) içine ilave edildikten sonra süzülür.
  8. Süzme işlemi bittiğinde huni atılır.
  9. Süzmede kullanılan filtre steril edilen bir pens ile içine besi yeri–1 konulmuş olan 6 cm çaplı petriye yerleştirilir.
  10. Petri 35±0.50C’lık inkübatörde 24±2 saat süre bekletilir
  11. 24±2 saatlik inkübasyonun sonunda besi yeri–1 üzerinde bulunan fitredeki bakteri gelişmesi kontrol edilir.
  12. Bakteri kolonilerinin oluşmaması durumunda toplam koliform açısından negatif (toplam koliform içermemektedir) olarak değerlendirilir.
  13. Besi yeri-1’de 35±0.50C’de 24 saatlik inkübasyon sonucunda oluşan koyu kırmızı metalik parlak, kırmızı, pembe renk ve her ihtimale karşı renksiz koloniler sayılır ve her renk grubunun toplam sayısı petri üzerine yazılır.

 

Doğrulama Deneyi

  1. Toplam koliform ve E. coli bakterilerinin doğrulama deneyi olarak, yukarıda sayılan renklerin her birinden rast gele seçilen karakteristik kolonilerin alt kültürleri yapılır.
  2. Alt kültürlerini yapmak için, seçilen karakteristik koloniler besi yeri–2 üzerine azaltma usulü ile yayılarak aktarılır.
  3. 35±0.50C’de 24±2 saat için inkübasyona kaldırılarak saf kültür elde edilir.
  4. İnkübasyon sonucunda elde edilen saf kültürler (veya membran üzerindeki karakteristik koloniler) oksidaz ve kovacs indole reaktifleri ile test edilir.
  5. Oksidaz testi için 2-3 damla taze hazırlanmış oksidaz reaktifi bir filtre kağıdı üzerine damlatılır. Cam pipet ile besi yeri-2 üzerindeki kolonilerden alınır ve hazırlanan filtre kâğıdı üzerine sürülür, 30 saniye içinde mor renk oluşumu pozitif (+) olarak kabul edilir.
  6. Oksidaz reaksiyonu negatif(-) veren tüm koloniler koliform bakteri olarak sayılır. Oksidaz reaksiyonu pozitif(+) veren koloniler koliform bakteri olmadığı için dikkate alınmaz.
  7. İndol deneyi için membran üzerindeki metalik parlak ve kırmızı koloniler triptofan sıvı besi yeri–3 içeren tüplerin içine pasaj yapılır.
  8. İndol deney numuneleri 44.5±0.20C’lik inkübatörlere kaldırılır.
  9. 24±2 saatlik süre sonunda inkübatörden alınır.
  10. Besi yeri-3 üzerine 0.3 mL damla Kovacs reaktifi tüplerin içine ilave edilmek suretiyle indol üretimi incelenir.
  11. Sıvı besiyeri üzerinde kiraz kırmızısı bir rengin oluşması indol üretimini pozitif (+) olarak doğrular.
  12. Oksidaz reaksiyonu negatif(-) tüm koloniler toplam koliform olarak sayılır.
  13. Oksidaz reaksiyonu negatif(-) ve indol reaksiyonu pozitif(+) veren tüm koloniler E.coli olarak sayılır.

 

Hesaplama

Tahmin deneyinde oluşan her renk ayrı ayrı sayılır ve sayımlar kaydedilir. Doğrulama deneyi sonunda hangilerinin koliform (oksidaz reaksiyonu negatif sonuç verenler) ve bunların hangilerinin E.coli (indol deneyi pozitif sonuç verenler) olduğu tespit edildikten sonra toplanarak sonuç verilir.

Toplam Koliform Bakteri,  CFU / 100 mL  = A*100/C

Escherichia coli,  CFU / 100 mL  = B*100/C

 

A; Doğrulama deneyi sonunda oksidaz reaksiyonu negatif(-) veren kolonilerin toplamı,
B; Doğrulama deneyi sonunda oksidaz reaksiyonu negatif(-) ve indol reaksiyonu pozitif(+) veren kolonilerin toplamı,
C; Çalışılan numune hacmi, mL
CFU; Coloni-Forming Units (Koloni Oluşturan Birimler(KOB)) 

 

Meraklısına Notlar

İki yöntemin kıyas tablosu:

Çoklu Tüp Yöntemi Membran Filtre Yöntemi
Daha uzun sürede sonuç verir. Daha kısa sürede sonuç verir.
Daha fazla besi yeri kullanılır. Daha az besi yeri kullanılır.
Daha fazla cam malzeme kullanılır. Daha az cam malzeme kullanılır.
Sonuçlar dolaylı istatiksel hesaplama yöntemiyle bulunur. Sonuçlar doğrudan koloni sayılarak elde edilir.
Laboratuvar ortamında çalışılır, arazide çalışılması zordur. Hem laboratuvar, hem de arazide çalışmak mümkündür.
Bütün sulara uygulanabilir. Bulanık ve renkli sularda çalışmak sorun yaratabilir.

Toplam koliform bakteri ve Escherichia coli tayininin yapıldığı iki yöntemin çeşitli avantajları ve dezavantajları vardır. Çalışma yöntemi seçilirken bunlar göz önünde bulundurularak yapılacak çalışma amaca daha uygun olacaktır.