T.KOLİFORM BAKTERİ ve E.COLİ TAYİNİ
(
MEMBRAN FİLTRE YÖNTEMİ)

Kullanılan Cihazlar

İnkübatör–1: 35±0.50C’lık ortam sıcaklığı sağlayan inkübatör kullanılır. İnkübasyon sırasındaki nem kaybının %15’den fazla olmaması için inkübatörün en altına bir kap içinde su koymak yeterli olabilir.

İnkübatör–2: 44.5±0.20C’lık ortam sıcaklığı sağlayan inkübatör kullanılır. İnkübasyon sırasındaki nem kaybının %15’den fazla olmaması için inkübatörün en altına bir kap içinde su koymak yeterli olabilir. 

Süzme Sistemi: Paslanmaz çelikten yapılmış, bek alevi ile yakılarak steril edilebilen ve membran filtre ile süzme yapılabilen vakumlu süzme sistemi kullanılır. 

Otoklav (Buharlı Sterilizatör): 1210C’lık sıcaklık ve 1.2 atmosfer basıncı sağlayan otoklav kullanılır. 

Fırın: 1750C’lık sıcaklık sağlayan fırın sterilizasyon işleminde kullanılır. 

Analitik Terazi: Terazi 0.1 mg hassasiyete sahip olmalıdır. 

Su Banyosu: Su sıcaklığı 0.20C hassasiyetle ayarlanabilen, 1000C su sıcaklığı sağlayan su banyosu kullanılır.

pH Metre: pH metre 0.1 birim hassasiyete sahip olmalıdır. 

Bunsen Beki: Doğalgaz veya LPG gaz ile çalışabilen bunsen beki yakma işlemlerinde kullanılır. 

Deney Tüpleri: 18 mm çaplı 180 mm uzunluğundaki deney tüpleri kullanılır. Otoklava konduğunda ağzını kapatacak klipsli kapağı da bulunmalıdır. Deney tüpleri tüp taşıyıcı ile birlikte kullanılır. 

Pens: Steril edilebilen paslanmaz çelikten yapılmış yuvarlak uçlu pens kullanılır. 

Huni: Süzme sistemine takılabilen, steril, 100 mL su alabilen, atılabilir huni kullanılır. 

Filtre Kâğıdı: Gözenek açıklığı 0.45 µm olan 47 mm çapında steril membran filtre kullanılır. Aşağıdaki filtrelerden biri veya eşdeğer Cellulose Nitrate herhangi bir filtre kullanılabilir.

  1. Sartorius marka Cellulose Nitrate filtre 11406–047,
  2. Millipore marka Cellulose Nitrate filtre HAWG 047 S1.

 

Kullanılan Kimyasal Maddeler

Besi Yeri–1 (M-Endo Broth MF):

  1. Kullanılan Kimyasallar: Difco marka (274930), Merck marka (110750) hazır besi yeri veya tryptose, thiopeptone, casitone, yeast extract, lactose, di-potasyum hidrojen fosfat, sodyum klorür, potasyum di-hidrojen fosfat, sodyum lauryl sülfat, sodyum sülfit, sodyum desoxycholate, basic fuchsin ve agar kullanılarak hazırlanan besi yeri kullanılır.                                                                  
  2. Hazırlanışı; hazır besi yerinin 48.0 gramı veya kimyasal maddelerin aşağıda verilen miktarları bir balon içerisine konur ve üzerine 20 mL %95’lik etil alkol içeren 1 L saf su ilave edilir. Su banyosunda kaynama noktası yakınında eritilir.

    Tryptose  10.0 g
    Thiopeptone 5.0 g
    Casitone  5.0 g
    Yeast Extract  1.5 g
    Lactose    12.5 g
    Di-potasyum Hidrojen Fosfat 4.375 g
    Sodyum Klorür   5.0 g
    Potasyum Di-hidrojen Fosfat   1.375 g
    Sodyum Lauryl Sülfat    0.05 g
    Sodyum Desoxycholate 0.1 g
    Sodyum Sülfit 2.1 g
    Basic Fuchsin 1.05
    Agar 15.0 g

    45–500C’a kadar soğutulur. pH=7.2±0.1 olmalıdır. Besi yeri–1 6 mm çaplı steril petri kaplarına steril bir pipetle 5 mL hacimlerle dağıtılır. Buzdolabında, karanlıkta saklanır. İki hafta içerisinde kullanılmalıdır.


  3. Besi yerinin görevi bakterilerin gelişerek tespit edilir duruma gelmesini sağlamaktır. 

Besi Yeri–2 (Tryptic Soy Agar-TSA):

  1. Kullanılan Kimyasallar: Difco marka (236950), Oxoid marka (CM0131), Fluka marka (22091), Merck marka (105458) hazır besi yeri veya tryptone, soya peptone, sodyum klorür ve agar kullanılarak hazırlanan besi yeri kullanılır.                                                                  
  2. Hazırlanışı; hazır besi yerinin 40.0 gramı veya kimyasal maddelerin aşağıda verilen miktarlar 1 L saf su ile bir balon içerisine konur ve su banyosunda ısıtılarak eritilir.

    Tryptone 15.0 g
    Soya Peptone   5.0 g
    Sodyum Klorür 5.0 g
    Agar 15.0 g

    Besi yeri–2 15 mL’lik hacimlerle tüplere dağıtılır. Tüplerin ağzı kapatılarak otoklavda 1210C sıcaklıkta 15 dakika tutularak steril hale getirilir. Sterilizasyondan sonra 250C’da pH=7.3±0.2 olmalıdır. 50±50C’a kadar soğuması için beklenir. 10 cm. çaplı petri kaplarına dökülür.


  3. Tahmin deneyinde oluşan muhtemel toplam koliform ve Escherichia coli kolonilerinin doğrulama deneyinde kullanılmak üzere saf kültür elde etmek için kullanılır.

Besi Yeri–3 (DEV Tryptophan Broth):

  1. Kullanılan Kimyasallar: Merck marka (110694), Fluka marka (31406) hazır besi yeri veya peptone, tryptophan, sodyum klorür kullanılarak hazırlanan besi yeri kullanılır.                                                   
  2. Hazırlanışı; hazır besi yerinin 30.0 gramı veya kimyasal maddelerin aşağıda verilen miktarlar 1 L saf su ile bir balon içerisine konur ve su banyosunda ısıtılarak eritilir.

    Peptone    10.0 g
    Tryptophan    1.0 g
    Sodyum Klorür 5.0 g

    Her deney tüpüne 3 mL olarak dağıtılır. Tüplerin ağzı kapatılarak otoklavda 1210C sıcaklıkta 15 dakika tutularak steril hale getirilir. Sterilizasyondan sonra 370C’da pH=7.2±0.2 olmalıdır.


  3. Elde edilen alt kültürlerden saf kültür üretmek için kullanılır.

Oksidaz (Oxsidase) Reaktifi:

  1. Kullanılan Kimyasallar: Hazır test kağıtları veya N,N,N’,N’-Tetramethyl-1,4-phenylene-diamine dihydrochloride kullanılarak hazırlanan reaktif kullanılır.
  2. Hazırlanışı; 0.1 g N,N,N’,N’-Tetramethyl-1,4-phenylene-diamine dihydrochloride 10 mL saf suda çözülerek hazırlanır. Her zaman taze olarak hazırlanıp kullanılmalıdır.
  3. Alt kültürleri yapılan kolonilerin koliform bakteri olup olmadığının tespiti için kullanılır.

Kovacs İndole Reaktifi:

  1. Kullanılan Kimyasallar: Fluka marka (67309), Merck marka (109293) hazır besi yeri veya 4-(Dimethylamino) Benzaldehyde, 3-Methyl-1-butanol ve hidroklorik asit kullanılarak hazırlanan besi yeri kullanılır.
  2. Hazırlanışı; hazır reaktifler veya kimyasal maddelerin aşağıda verilen miktarlar karıştırılarak elde edilen reaktif kullanılır.

    4-(Dimethylamino) Benzaldehyde   5.0 g
    3-Methyl-1-butanol 75.0 m
    Hidroklorik Asit 25.0 mL

  3. Alt kültürleri oksidase testi ile koliform bakteri olarak tespit edilenlerin Escherichia coli olup olmadığının tespiti için kullanılır.

Seyreltme Suyu (Peptone’lu Su):

  1. Kullanılan Kimyasallar: Oxoid marka (CM0009), Fluka marka (70179) hazır seyreltme suyu reaktifi veya peptone ve sodyum klorür kullanılarak hazırlanan seyreltme suyu kullanılır.
  2. Hazırlanışı; hazır seyreltme suyu reaktifinin 15.0 gramı veya kimyasal maddelerin aşağıda verilen miktarlar 1 L saf su ile bir balon içerisine konur ve eritilir.

    Peptone  10.0 g
    Sodyum Klorür  5.0 g

    Hazırlanan seyreltme suyu ağzı kapatılarak otoklavda 1210C sıcaklıkta 15 dakika tutularak steril hale getirilir. Oda sıcaklığında saklanır.

  3. Numunelerde seyreltme yapılacağı zaman seyreltme işlerinde kullanılır.